安全操作液氮罐规范及其不同样品冻存方法

　　液氮罐在生物样品存储中广泛应用，因其能够提供极低的温度环境，从而实现样品的长期保存。为了确保操作安全及样品的有效冷冻保存，正确使用液氮罐至关重要。液氮罐通常用于保存细胞、组织、DNA、RNA等生物样品，操作不当不仅可能导致样品损失，还可能造成安全隐患。液氮的温度低至-196℃，对人体和物品都有极大危害，因此在操作时需要特别小心。

　　液氮罐操作规范

　　液氮罐在使用过程中必须遵守严格的安全操作规范。液氮为无色、无味、无臭的液体气体，具有极低的温度和高挥发性，存放和运输时需要采取适当措施，避免对人员和环境造成伤害。

　　1. 穿戴防护装备

　　操作液氮罐时，工作人员应穿戴专用的防护装备，包括防护眼镜、面罩、耐低温手套和穿着长袖、长裤等防护衣物，以防止液氮溅出导致冻伤。

　　2. 选择合适的操作环境

　　液氮罐应放置在通风良好的环境中，避免密闭空间内操作，防止液氮蒸发后气体浓度过高，造成缺氧或窒息等危险。应避免靠近火源、高温物体或明火设备，因为液氮的蒸发可能引起爆炸。

　　3. 使用时注意压力管理

　　液氮罐在使用过程中会不断蒸发产生气体，因此必须定期检查罐体的压力是否正常。对于长期保存样品的液氮罐，应保持液氮液面在适当的高度，过低可能导致样品无法保持低温状态。

　　4. 清洁和维护

　　定期对液氮罐进行清洁和维护，检查罐体的外部和内部是否有裂纹、损坏或腐蚀现象。清洁时，使用干净的无纤维脱落的布料，避免污染样品。

　　5. 液氮的注入

　　液氮应通过专业的注入装置加注到液氮罐中，操作时应避免直接接触液氮，并确保注入口与罐体的密封良好，以防气体泄漏。

　　样品冻存方法

　　液氮罐主要用于生物样品的冻存。冻存过程中的操作规范直接影响样品的存活率和后续的复苏效果。不同种类的生物样品具有不同的冻存要求，以下是几种常见样品的冻存方法。

　　1. 细胞冻存

　　细胞的冻存是最常见的液氮罐应用之一。冻存前需要对细胞进行处理，以减少细胞在冷冻和复苏过程中的损伤。冻存步骤如下：

　　- 细胞收获：将细胞培养液离心，去除培养基，获取细胞沉淀。

　　- 细胞重悬：使用含有保护剂(如DMSO、甘油)的冻存液重悬细胞。DMSO一般浓度为10%，能够有效防止细胞在冷冻过程中由于冰晶形成导致的损伤。

　　- 分装样品：将细胞悬液分装到冻存管中，每个冻存管的体积不宜超过1mL，以便均匀冷冻。

　　- 逐步降温：将冻存管放入-80℃的冷冻箱中逐渐降温至-80℃，然后再转移到液氮罐中进行长期保存。

　　- 冻存后检测：冻存后的细胞在复苏后要通过活性染色、细胞计数等方法检测细胞的存活率和活性。

　　2. 组织样本冻存

　　组织样本的冻存需要特别注意保护结构和功能。冻存方法与细胞类似，但通常需要加入更多的保护剂，如甘油、二甲基亚硫酰胺(DMSO)等。

　　- 组织取样与处理：通过外科手术取出所需组织，进行适当的切割处理，确保每块组织的大小适中，以便更好地渗透保护剂。

　　- 加入保护剂：将组织放入冷冻保护液中，常用的冻存液包括含有10%-20% DMSO和10%-20%甘油的溶液。确保样品充分浸泡。

　　- 降温过程：将处理过的组织逐步降温到-80℃，然后转入液氮罐中。

　　3. DNA/RNA冻存

　　DNA和RNA样品保存时需要避免降解。冻存时，建议使用缓冲液保护其完整性，常用的冻存液包括TE缓冲液或含有RNA保护剂的溶液。

　　- 样品处理：提取纯化DNA/RNA后，加入适当浓度的保护液。

　　- 冻存步骤：将含有DNA/RNA的样品分装在冻存管中，确保每个冻存管的体积不超过200μL。

　　- 保存与复苏：冻存时应确保冻存管密封良好，避免泄漏。复苏时，需迅速取出样品，并立即在冰上解冻。

　　4. 血液样品冻存

　　血液样品中含有丰富的血细胞和血浆蛋白，其冻存需要特殊处理以保证细胞和分子结构的完整性。

　　- 血液分离：通过离心分离血浆和血细胞，通常使用低速离心(约1500g)，分离后的血浆可用于冻存。

　　- 加入保护剂：血液样品中常用的冻存保护剂为10% DMSO。对于血液细胞冻存，建议使用红细胞保护剂。

　　- 分装与冷冻：血液分装至冻存管中，快速降温至-80℃，再转入液氮罐中进行长期保存。

　　液氮罐的正确使用与样品冻存方法的严格执行是确保生物样品长期保存和复苏成功的关键。在操作过程中，每一个环节都不能忽视，确保液氮的稳定供应和样品的完整性。